Клональное микроразмножение жимолости в производственных условиях

В настоящее время процесс производства высококачественного сертифицированного посадочного материала садовых растений требует привлечения высокотехнологичных методов, в том числе и биотехнологических. В отличие от сугубо лабораторных приемов, производственные технологии должны быть относительно простыми, хорошо воспроизводимыми, но в то же время обеспечивать максимальную эффективность на каждом этапе производства посадочного материала. В результате исследований, проведенных на базе Научно-производственного центра биотехнологии «Фитогенетика» (Тула) с целью совершенствования процесса клонального микроразмножения жимолости, предложена новая технология её размножения в производственных условиях. В эксперименты были включены сорта жимолости Альтаир, Амфора, Волшебница, Мальвина, Нимфа и другие. Для каждого этапа процесса клонального микроразмножения, начиная с введения в стерильную культуру и заканчивая адаптацией к нестерильным условиям, подобран минеральный состав питательных сред, регуляторы роста и их концентрации, а также физические условия культивирования. Среди испытанных рецептов питательных сред, использование минеральной основы по прописи Ли и де Фоссарда на этапе пролиферации, у подавляющего большинства изучаемых сортов жимолости обеспечивало максимальный коэффициент размножения, тогда как питательная среда на основе минеральных солей по Мурасиге-Скугу приводила к развитию наиболее длинных побегов. Выявлен положительный эффект культивирования под люминесцентными лампами с преобладанием излучения в красной части спектра на развитие микрорастений жимолости. Проведен экономический анализ использования усовершенствованной технологии в научно-производственном центре «Фитогенетика». Расчеты показали относительно высокий (более 90 %) уровень рентабельности клонального микроразмножения жимолости при использовании усовершенствованной технологии включающей новые элементы, отработанные в ходе проведения настоящих исследований.

При размножении новых сортов сельскохозяйственных культур, здорового посадочного материала и других ценных генотипов все более широкое применение находят относительно новые приемы, включая и биотехнологические. Основные преимущества хорошо известны [1]. Размножение в производственных условиях имеет некоторые особенности. Это максимальная простота и технологичность операций, сведение потерь материала к минимуму на всех этапах культивирования, хорошая воспроизводимость результатов. Наши исследования и были направлены на решение этих актуальных задач. Эксперименты проводили, начиная с 2011 г., на предприятии НПЦ Биотехнологии «Фитогенетика » в структурном подразделении ГУП КБ приборостроения, в теплице и лабораториях предприятия (Тула), с использованием стандартных методик работы с культурами изолированных тканей и органов растений. В опыты были включены перспективные сорта и формы жимолости синей, на посадочный материал которых существует стабильно спрос [5], так как эта культура дает в сезоне плоды, характеризующиеся высоким содержанием витаминов и других биологически активных веществ [4]. Одной из характеристик устойчивости производства является непрерывность процесса. В то же время известно, что введение эксплантов в стерильную культуру для большинства видов растений проходит наиболее успешно в случае их отбора в фазу активного роста. Таким образом, достаточно длительный зимний период оказывается бесполезным, с точки зрения инициации стерильных культур.

С целью расширения периода введения эксплантов в культуру и обеспечения возможности работы с материалом в зимний период использовали биологические особенности растений жимолости – относительно короткий период физиологического покоя и легкую пробудимость почек. Для этого, начиная с февраля с зимующих растений, нарезали черенки длиной 20-25 см, промывали их водопроводной водой и в сосудах с водой помещали в светокамеры с температурой 20-22 °С. Приблизительно через 2 недели почки прорастали, и отросшие побеги можно было использовать в качестве исходного материала для введения в стерильную культуру. Как показали наши эксперименты с сортами жимолости Амфора, Морена, Нимфа, Фиалка и некоторыми другими, использование такого приема обеспечивало высокую долю эксплантов, успешно вводимых в культуру, причем их зараженность сапрофитной микрофлорой была ниже по сравнению с эксплантами, взятыми непосредственно с растений, произрастающих в полевых условиях.

Следующий этап — собственно микроразмножение, когда из каждого экспланта развиваются несколько дополнительных побегов (рис. 1). Испытывали два состава питательных сред — на основе минеральных солей по Мурасиге-Скугу (МС [7] и на основе рецепта Ли и де Фоссарда (ЛФ)) [6]. Эксперименты показали, что более высокий коэффициент размножения был характерен для эксплантов подавляющего числа изученных сортов, культивируемых на питательной среде, приготовленной на основе минеральных солей по Ли и де Фоссарду. Показатель средней длины развивающихся побегов был выше на питательной среде Мурасиге-Скуга [2].

Рис. 1. Массовое образование побегов у эксплантов жимолости сорта Нимфа

При укоренении растений выяснилось, что более эффективно, чем обработка ауксинсодержащей пудрой и отдельное добавление в среду ИМК или ИУК в аналогичных концентрациях, совместное введение в питательную среду ИУК — 0,5 мг/л и ИМК — 0,5 мг/л ИУК. Укореняемость микропобегов, вовлеченных в эксперименты сортов на изученных средах, составляла практически 100 %. В контрольном варианте без добавления индукторов корнеобразования в среду растения практически не давали корней. Наибольшее число корней развивалось при совместном добавлении в питательную среду для ризогенеза ИУК и ИМК по 0,5 мг/л. При обогащении среды только ИМК в концентрации — 0,5 мг/л или ИУК в такой же концентрации число корней было существенно меньше [2].

В ходе работы изучили влияние различных источников света на рост и развитие микрорастений жимолости на этапе укоренения. Исследовали следующие источники освещения:

• люминесцентные и лампы белого свечения ЛБ-40 (контроль, белый свет);
• люминесцентные лампы ЛФ-40-5 (преобладание излучения в синей части спектра);
• люминесцентные лампы ЛФ-40-4 (преобладание излучения в красной части спектра).

Опыты проводили на сортах жимолости Волшебница, Волхова, Мальвина, Амфора и Альтаир. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Средняя высота растений (см) при культивировании под различными источниками освещения

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, практически все микрорастения жимолости испытанных сортов более интенсивно развивались при использовании ламп ЛФ40-5 с преобладанием излучения в синей части спектра.

Использование этих ламп приводило также к увеличению числа корней у микропобегов на этапе ризогенеза, однако суммарная длина корней по сравнению с контролем была несколько меньше

Адаптация пробирочных микрорастений к нестерильным условиям – важный этап клонального микроразмножения, который при неправильной организации может свести «на нет» все положительные моменты клонального микроразмножения, поэтому в своей работе мы отрабатывали этот этап с особой тщательностью. В результате проведенных экспериментов было убедительно продемонстрировано положительное влияние регуляторов роста нового поколения (Эпин-экстра и Силиплант) на приживаемость микрорастений жимолости в почвенных субстратах и их дальнейшее развитие [3]. Был достигнут высокий процент приживаемости микрорастений жимолости (рис. 2), которые, пройдя затем относительно короткий этап доращивания, были готовы к реализации (рис. 3)

Рис. 2. Адаптация микрорастений жимолости сорта Волшебница к нестерильным условиям

Рис. 3. Подготовленные к реализации микроразмноженные растения жимолости съедобной

Приемлемость и жизнеспособность любой технологии обуславливается экономической эффективностью, которую она может обе-спечить. С учетом положительных моментов, разработанных в ходе выполнения исследований (повышения коэффициента размножения, сокращения сроков укоренения, адаптации к нестерильным условиям и доращивания), нами была проведена оценка экономической эффективности усовершенствованной технологии клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях на базе НПЦ Биотехнологии «Фитогенетика». Результаты расчетов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Рентабельность усовершенствованной технологии клонального микроразмножения жимолости

Таким образом, в результате работы выявлена существенная сортоспецифичность эксплантов жимолости различных сортов на культивирование in vitro в отношении коэффициента размножения и параметров образуемой корневой системы в зависимости от освещения светом разного спектрального состава, что необходимо учитывать в прак-тической работе. Показана эффективность использования регуляторов роста нового поколения на этапе адаптации микрорастений к нестерильным условиям. Все эти моменты были учтены при создании усовершенствованной технологии клонального микроразмножения жимолости, которая обеспечила при использовании в НПЦ Биотехнологии «Фитогенетика» уровень рентабельности производства до 90 % и более.

Литература

 
1. Высоцкий В.А. Перспективы внедрения микроразмножения в производство // Садоводство и виноградарство, 1988.-№ 12.-С. 14-17.
2. Валиков В.А., Высоцкий В.А. Совершенствование приемов клонального микроразмножения жимолости для производственных условий // Плодоводство и ягодоводство России: сб. научн. работ. — Т. XXXVII. Ч. 1. — С. 57-62.
3. Высоцкий В.А., Валиков В.А. Использование регуляторов роста нового поколения на этапе адаптации микрорастений жимолости // Плодоводство и ягодоводство России: сб. научн. работ. — Т. XXXVIII. Ч. 1. — М., 2013 — С. 82-87.
4. Плеханова М.Н. Жимолость синяя в саду и питомнике. — СПб.: ВНИИР, 1998. — 66 с.
5. Шипунова А.А. Клональное микроразмно-жение садовых культур: дисс. на соиск. уч. степ, канд. с.-х. наук. — Тула, 2003. — 173 с.
6. Lee E.S.M., De Fossard R.A. Regeneration of strawberry plants from tissue cultures // Proc.Pl. Propag. Soc., 1975. -V. 25. — P. 277-285.
7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant., 1962. — V. 15. — N° 3. — P. 473-497.