Регенерационная способность эксплантов рода Rubus L. различного происхождения

Проблема разработки эффективных, надежных, хорошо воспроизводимых методов получения регенерантов в культуре листовых дисков и иных комплексных эксплантов остается важной и актуальной для различных областей растениеводства, таких, как селекция и размножение растений, вирусология, генетика и физиология. В своих экспериментах мы изучали регенерацию in vitro целых растений из листовых дисков и отрезков междоузлий ежевики (Rubus sp.) и малины красной (Rubus udaeus). Было продемонстрировано, что использование отрезков междоузлий обеспечивало самый высокий уровень регенерации побегов по сравнению с культурой листьев и листовых дисков, для культуры изолированных пыльников был характерен самый низкий. Частота каллусообразования у культивируемых пыльников зависела от фазы развития пыльцы. Для увеличения выхода регенерантов в культуре листовых дисков была проведена оптимизация состава питательной среды по концентрации препаратов с ауксиновой и цитокининовой активностью. Было установлено, что предварительное культивирование листовых дисков в условиях пониженной освещенности увеличивало частоту регенерации. Аналогичного эффекта можно было добиться, нанося поранения на листовые пластинки в зоне центральной жилки. Частота регенерации была связана с видовыми и сортовыми особенностями растений, составом питательной среды и условиями культивирования. Разработанные приемы могут быть использованы в работах по генетической инженерии, вирусологии, сомаклональной селекции, размножению растений, включая создание искусственных семян.

Сорт ежевики Дарроу

При решении задач надежного получения плодовых, ягодных и декоративных культур из единичных клеток методы клеточной селекции позволяют проводить отбор в контролируемых селективных условиях. Особенно интересным аспектом применения биотехнологических методов является возможность индукции генетических изменений для придания растительным организмам необходимых признаков.

В настоящее время наиболее эффективными методами индукции изменений считаются следующие [1]:

1. регенерация из комплексных эксплантов для получения сомаклональных и гаметоклональных вариантов;
2. мутагенез in vitro с последующей регенерацией растений;
3. получение растений с измененной плоидностью;
4. различные операции с протопластами;
5. генетическая трансформация, в том числе с использованием бактериальных векторов.

Практически все перечисленные позиции могут быть осуществлены только при наличии надежных способов регенерации растений из тех или иных типов эксплантов. Для большинства плодовых и ягодных культур наиболее перспективными, по-видимому, являются направления регенерации растений из комплексных эксплантов типа листовых дисков, каллусной ткани и пыльников, отработанные для некоторых видов растений. Использование таких структур перспективно также для отбора сомаклональных вариантов, как это было продемонстрировано на примере получения сомаклонов яблони, обладающей повышенной устойчивостью к возбудителю бактериального ожога (Erwinia amylovora) [2] и различной способностью к пролиферации in vitro и ризогенезу [3].

Культура пыльников позволяет гораздо быстрее создать гомозиготные диплоидные линии по сравнению с традиционными методами селекции. Гаплоидное состояние дает возможность обнаружить рецессивные мутации сразу же после воздействия мутагенами, а в случае появления гаметоклональных вариантов отобрать формы с полезными признаками.

Имеются сведения о культивировании пыльников ежевики, малины и их гибридов, вишни, черемухи, вишне-черемуховых и вишне-черешневых гибридов [4, 5]. Однако информация о получении регенерантов-гаплоидов этих культур пока отсутствует.

Несмотря на довольно большое число работ по культуре пыльников плодовых растений, еще не удалось создать надежную методику по-лучения гаплоидов in vitro. Исследователи в основном изучали влияние гормонального и минерального составов питательных сред, фазы развития пыльцы, методы стерилизации бутонов, физические факторы культивирования. Практически не изучены потребности культивируемых пыльников в сахарах, не определены их требования к уровню осмотического давления в зависимости от целей культивирования.

Для систем генетической трансформации с использованием в качестве вектора Agrobacteriun большой интерес представляет культура листовых дисков садовых растений. Положительные результаты в получении регенерантов из листовых дисков рода Rubus были достигнуты, в частности, в работах сотрудников нашего института [6]. Авторы изучали особенности регенерации целых растений ежевики (Rubus sp.), малины черной (Rubus occidentalis L.) и красной (Rubus idaeus L.) из листовых дисков, листьев, черешков и отрезков междоузлий in vitro . Было установлено, что наиболее высокой способностью к регенерации побегов обладали отрезки междоузлий, наиболее низкой — листовые диски. Экспланты ежевики сорта Торнфри, малины черной и красной образовали большее число регенератов при культивировании на среде со смесью БАП + ИУК по сравнению с применением одного БАП. Экспланты малины красной обладали более высокой регенерационной способностью, чем ежевики и малины черной. Хотя основным фактором регулирования органогенеза in vitro у большинства растений является соотношение экзогенных ауксинов и цитокининов, несомненное влияние может оказать также интенсивность освещения на разных этапах органогенеза [7].

Малина черная сорт Кумберленд

Однако для плодовых и ягодных культур уровень разработки этого метода для практического использования еще недостаточен.

Целью наших исследований являлось изучение закономерностей регенерации растений рода Rubus в культуре эксплантов различного происхождения.

В качестве объектов исследований использовали ежевику сортов Агавам, Дарроу и Торнфри (Rubus sp.), малину черную сорта Кумберленд (Rubus occidentalis L.) и малину красную (Rubus udaeus L.) сортов Бабье лето, Глен Клова, Скромница. Инициальные экспланты заготавливали с 2-5-летних маточных растений. Стерилизацию материала проводили в 0,1 % растворе диацида в течение 10 мин. последующей 3-4-кратной промывкой в стерильной воде. На питательную среду высаживали почки размером 2-3 мм и меристематические верхушки размером 0,3-0,5 мм. После 3-4 субкультивирований на среде для размножения брали экспланты для экспериментов по регенерации. Диаметр листовых дисков составлял 4-8 мм, размер отрезков междоузлий — 3-6 мм. Экспланты поме-щали на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением следующих компонентов (мг/л): аскорбиновая кислота — 1,0; тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота — по 0,5; мезо-инозит — 100; сахароза — 30000, агар — 6500. рН среды устанавливали в пределах 5,5-5,7. Из регуляторов роста в питательную среду включали 6-бензиламинопурин (БАП) (0,1-1,0 мг/л), гибберелловую кислоту (ГК) (0,1 мг/л), ß-индолилуксусную кислоту (ИУК) (0,1-1,0 мг/л) и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) (0,1-0,5 мг/л) в различных сочетаниях. Культивирование проводили при интенсивности освещения 2000 лк, температуре 25 °С и фотопериоде 16 ч. Число повторностей в каждом варианте- от 12 до 3 0. Учитывали число регенерировавших эксплантов (в % к общему числу высаженных), среднее число побегов и листьев на 1 эксплант, среднюю длину побегов в миллиметрах.

Нашими наблюдениями не выявлено случаев прямого эмбриогенеза в культуре пыльников ежевики и малины. Промежуточной стадией на пути получения растений-регенерантов было образование каллусных тканей, поэтому, нами были изучены факторы, оказывающие воздействие на каллусогенез у пыльников и регенерацию вегетативных органов в каллусной культуре.

Сорт ежевики Торнфри

Способность пыльников ежевики к каллусообразованию зависела от фазы развития пыльцы и сортовых особенностей. У сортов Агавам и Торнфри наибольший процент образования каллусов показали пыльники, изолированные на протяжении всего мейоза (5-13 %), а для ежевики дольчатой — от тетрад ядер до одноядерных микроспор (до 25 %). Использование в качестве эксплантов пыльников со зрелыми пыльцевыми зернами во всех случаях снижало частоту образования каллуса. Наибольшую способность к каллусогенезу отмечали у пыльников ежевики дольчатой, наименьшую — у сорта Агавам. Цитологический анализ пыльцы в пыльниках, не образовавших каллус, позволил выяснить, что пыльца в ранней фазе развития (до образования тетрад ядер) и поздней фазе (пыльцевое зерно) деградировала. В фазе от тетрад до микроспор наряду с деградацией у некоторых микроспор отмечали остановку в развитии. Это, на наш взгляд, свидетельствует о преимуществе использования пыльников с пыльцой в фазе от тетрад до микроспор по сравнению с другими фазами.

Наши эксперименты показали, что пыльники с пыльцой, находящейся в разных фазах развития, не одинаково реагируют на минеральный состав питательной среды. Пыльники с пыльцой в ранней фазе развития (до образования тетрад) наибольшее число каллусов (8,8 % от числа высаженных пыльников) образовывали на относительно богатой среде Мурасиге-Скуга, в фазах от тетрад до микроспор и зрелых пыль-цевых зерен — соответственно на более бедных средах Нич-Нича (8,3 %) и N6 (4,2 %). Отсюда можно предположить, что по мере созревания пыльцы потребность пыльников в питательных веществах в культуре in vitro снижается.

Предварительное центрифугирование пыльников ежевики, обработка пониженными температурами или совместное использование обоих этих приемов перед высадкой пыльников на питательную среду также влияло на каллусообразование. Наибольший процент каллусообразования был отмечен при совместном действии указанных факторов. Вариант с применением пониженной температуры существенно не отличался от контрольного, в то время как применение одного центрифугирования заметно снижало процент пыльников,- образовавших каллус. Возможно, последнее связано с гибелью большого числа микроспор в условиях высокой скорости вращения.

В ранней фазе развития пыльцы (до образования тетрад ядер) образование каллуса происходило наиболее активно при обработке пониженными температурами и центрифугированием, а в фазе от тетрад до микроспор — в вариантах с пониженными температурами и при сочетании обработки холодом с центрифугированием. При этом в фазе зрелого пыльцевого зерна отмечали малую эффективность вариантов предварительной обработки.

Наиболее пригодной для стимуляции каллусогенеза у ежевики сорта Агавам и большинства испытанных сортов малины красной оказалась модифицированная среда Мурасиге-Скуга. Несколько менее эффективными были среды Нича и N6. На среде Хеллера каллусообразование почти отсутствовало, вероятно, по причине низкой концентрации азотсодержащих солей.

Сорт ежевики Агавам

Для ежевики сорта Торнфри и ежевики дольчатой показано преимущество использования среды Уайта, на которой эффективность каллусогенеза составила 22 и 29 % соответственно.

Испытание различных сочетаний БАП и препаратов ауксиновой природы позволило выявить, что наиболее активно стимулировали образование каллуса варианты с включением 2,4-Д.

Использование комбинированной среды (жидкой с твердой агаризованной подложкой) способствовало увеличению процента пыльников, сформировавших каллус, в 1,8 раза, но вместе с тем снижало рост каллуса в 2,4 раза. Возможно, этот эффект объясняется лучшей доступностью питательных элементов и регуляторов роста из жидкой фракции питательной среды.

Как было показано нами в ранних работах, процесс образования побегов и полностью развитых растений из каллуса, сформировавшегося в культуре пыльников ежевики и малины, был затруднен: из 10 тыс. высаженных пыльников ежевики был получен лишь один регенерант [8]. Цитологический анализ его клеток показал диплоидную природу. Ни одного случая регенерации побегов из пыльников у изученных сортов малины красной зарегистрировано не было.

Использование мальтозы вместо сахарозы и глюкозы для культуры пыльников представителей рода Rubusоказалось малоэффективным.

По-иному вели себя листовые диски малины красной. Здесь нередки были случаи регенерации побегов непосредственно из клеток тканей листовой пластинки без образования каллуса [7, 9]. Мы попытались повысить частоту регенерации побегов путем изменения некоторых условий культивирования.

Эксперименты показали, что на регенерационные процессы в культуре листовых дисков малины оказали заметное влияние как соотношение БАП: ИМК, так и длительность культивирования эксплантов при пониженной освещенности (100 лк). Наибольшую эффективность для формирования регенерантов из ряда изученных комбинаций отметили для соотношений БАП и ИМК (2:1). При этом соотношении частота регенерации побегов практически не зависела от уровня освещенности (табл.). При соотношении БАП и ИМК 2:0,5 или 1:1 наблюдали существенную зависимость регенерационных процессов от длительности пребывания эксплантов после посадки в условиях пониженной освещенности. При этом чем ниже была концентрация ауксина, тем большую частоту регенерации побегов отмечали при более длительном пребывании эксплантов в условиях дефицита света. Рост адвентивных побегов также зависел от соотношения в питательной среде БАП и ИМК. Формирование наиболее развитых регенерантов наблюдали при комбинации 2 мг/л БАП и 2 мг/л ИМК. Самые развитые регенеранты были получены в вариантах с затенением продолжительностью 5-15 суток. Увеличение этого периода отрицательно влияло на развитие растений.

Сорт малины Скромница

Каждый из листовых дисков наиболее пластичных в отношении регенерации сортов малины, к которым относится сорт Скромница, обычно давал до 5 побегов-регенерантов. Их количество зависело от длительности затенения на первых этапах культивирования и особенно от соотношения БАП и ИМК. Чем меньше концентрация ИМК в питательной среде, тем более длинным должен быть период затенения для получения максимального числа побегов-регенерантов на каждом экспланте.

Органогенез в культуре листовых дисков малины
сорта Скромница в зависимости от концентрации ИМК и длительности культивирования при пониженной освещенности

На основании экспериментов была выявлена следующая закономерность. Чем больше концентрация ИМК отличалась от оптимальной, тем сильнее оказывался эффект продолжительности культивирования при пониженной освещенности на регенерационную способность листовых дисков малины. При пониженных концентрациях ИМК период затенения необходимо увеличивать, а при избыточной концентрации ауксина можно вообще обойтись без затенения. Как полное отсутствие ИМК в питательной среде, так и ее повышенные концентрации отрицательно сказывались на частоте регенерации и скорости роста регенерантов.

Практически для всех испытанных сортов листовые диски показали более высокую частоту регенерации по сравнению с листовыми пластинками, что, возможно, связано с более обширными поранениями эксплантов при получении высечек (рис. 1).

Рис. 1. Регенерация побегов в культуре листовых дисков малины красной сорта Скромница

В пользу этого говорит также тот факт, что искусственное поранение листовых эксплантов путем надрезания их вдоль главной жилки приводило к существенному увеличению частоты регенерации побегов листовыми пластинками (до 20 % по сравнению с 5 % в контроле). Хорошие результаты были получены и при использовании отрезков междоузлий, культивирование которых было относительно простым и обеспечивало удовлетворительный выход регенерантов практически у всех изученных сортов (рис. 2). Особенно эффективным этот прием оказался при более высоких концентрациях вводимых в питательную среду БАП и ИУК. Кроме того, возрастали и среднее число побегов на эксплант, и их длина.

Рис. 2. Регенерация побегов в культуре отрезков междоузлий у малины сорта Бабье лето

Прямую регенерацию побегов из тканей листовых и стеблевых эксплантов стимулировали при культивировании в жидкой перемешиваемой питательной среде в состоянии вращения. Однако этот прием не может быть признан универсальным, хотя его эффективность для земляники, нарцисса и некоторых других видов сомнений не вызывает [8-10].

Таким образом, подбором состава питательных сред, физических условий культивирования можно получать растения-регенеранты у различных видов плодовых и ягодных растений в культуре листовых дисков, отрезков междоузлий и других комплексных эксплантов. Разработанные приемы получения растений-регенерантов могут быть использованы в решении вопросов вирусологии, селекции и генетической инженерии.

Список используемой литературы

 
1. James D.J. Cell and Tissue culture technology for the genetic manipulation of temperate fruit trees // Biotechnol. Gen. Engineer. Rev., 1987. -V. 5. — P. 33-80.
2. Donovan A.M., Morgan R., Yalobra-Piagnani C., Ridout M.S., James D.J., Garlett M.M. Assesment of somaclonal variation in apple I. Resistance to the fire blight pathogen, Erwinia amylovora // The Journal of Horticultural Science, 1994. — V. 69, No 1. — P. 105-113.
3. Donovan A.M., Ridont M.S., James D.J. Assesment of somaclonal variation in apple. II. Rooting ability and shoot proliferation in vitro // The Journal of Horticultural Science, 1994. — V. 69, No 1. — P. 115-122.
4. Щекотова Л.А., Жуков О.С. Влияние света на культуру пыльников плодовых растений // Сб. тез. докл. — Львов, 1980. — С. 82-83.
5. Курса ко в Г. А., Зоточкина Т.В. Методические рекомендации по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-селекционных работах с плодовыми растениями. — ЦГЛ: Мичуринск, 1987. — 60 с.
6. Высоцкий В.А., Упадышев МЛ. Регенерация вегетативных органов листовыми дисками и другими эксплантами рода КиЪш т уИго // Физиология растений, 1992. — Т. 39, вып. 3. — С. 584-591.
7. Высоцкий В.А., Упадышев МЛ., Хамукова Ф.Н. Регенерация побегов земляники и малины в культуре каллусных тканей и листовых дисков // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология: тез. докл. II межд. конф. — Алматы, 1993. — С. 49.
8. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Перспективы использования метода культуры тканей и органов в селекционной работе с ежевикой и малиной черной // Использование клеточно-тканевых культур и селек-ционных биотехнологий в растениеводстве. — Новосибирск, 1993. — Вып. 1/2. — С. 45-54.
9. Высоцкий В.А., Соломонова Ф.Н. Регенерация побегов малины красной комплексными эксплантами в зависимости от условий культивирования // Плодоводство и яшдоводство России, 1994. — Т. I. — С. 58-62.
10. А.с. 1738169 РФ Способ размножения растений т уНго / Высоцкий В.А., Шершень И.А. // Бюл., 1992. -№21.