Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала винограда

Современное виноградарство России должно базироваться на производстве сертифицированного посадочного материала. Основная цель исследований заключалась в совершенствовании технологий клонального микроразмножения с использованием регуляторов роста. Задача состоит в получении здорового посадочного материала винограда и введение системы сертификации посадочного материала по образцу европейских стран.

Технология производства оздоровленного посадочного материала в качестве составной части включает биотехнологические приемы, комплексное оздоровление с использованием культуры изолированных апексов, ускоренное размножение оздоровленных экземпляров на искусственных питательных средах и создание коллекций оздоровленных форм in vitro

К основным преимуществам использования биотехнологических приемов можно отнести следующие:

• возможность получения оздоровленного от вирусов и бактериального рака посадочного материала;
• быстрое размножение ценных клонов;
• возможность работы в течении всего года и планирование выпуска материала к определенному сроку;
• при интродукции растений устраняется вероятность завоза и распространения карантинных растений;
• паспортизация сортов и форм с помощью молекулярно-генетического маркирования и установление филлогенетических связей;
• длительное хранение материала в условиях in vitro.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований явились комплексно-устойчивые сорта винограда селекции Всероссийского НИИВиВ имени Я.И.Потапенко, НИВиВ «Магарач» Украинской академии аграрных наук, молдавской, венгерской селекции и др.

В качестве исходного материала были взяты интенсивно растущие зеленые побеги винограда, которые разрезали на одноглазковые черенки и далее проводили вычленение меристем в ламинарных боксах.

Одноглазковые черенки перед вычленением меристемы стерилизовали в 2 %-м растворе гипохлорита натрия. Простерилизованные органы помещали в стерильную чашку Петри. Перед вычленением с верхушки глазка удаляли покровные чешуи, последовательно обнажая верхушечную меристему с примордиальными листочками. Эту операцию проводили с помощью препаровальной иглы под стереоскопическим микроскопом МБС-10, установленным в пылезащитной камере (ламинар-боксе). Вычленяли меристемы от 200 до 400 микрон специальной препаровальной иглой и немедленно помещали на поверхность агаризованной среды в чашки Петри, которые в свою очередь были размещены в культуральной комнате с соответствующими условиями: освещенность 3…4 тыс. люкс, температура 27…28С, относительная влажность воздуха 65…70 %.

При этом использовали модифицированную питательную среду MS (Мурасиге и Скуга) с витаминами: тиамин — 1 мг/л, пиридоксин — 1 мг/л, никотиновая кислота — 1 мг/л, мезоинозит — 50 мг/л, источник углерода (сахароза) — 2 %, агар — 0,7 % и доводили рН до 6,4…6,5.

В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли ауксины и цитокинины в различных концентрациях и сочетаниях. Из группы ауксинов было изучено влияние индолил-масляная кислота (ИМК) и индолил-уксусная кислота (ИУК), из группы цитокининов: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентил-аденин (2iP), кинетин, а также гибберелловая кислота (ГК).

Культивирование растительного материала осуществляли на первом этапе в чашках Петри, далее в пробирках размером 40 х 120 мм, содержащих 20 мл питательной среды.

Результаты исследований

Проведенные наблюдения показали, что на первом этапе выращивания (2 недели) часть меристем (40-60% в зависимости от сорта), начали некротизировать. Оставшиеся меристемы через месяц после посадки развились в микропобеги размерами 2…2,5 мм. Эти микропобеги повторно пересаживали на такую же по составу питательную среду. Пересадку производили в биологические пробирки.

Степень приживаемости апикальных меристем на этапе введения в культуру in vitro находится в среднем на уровне 40-50%.

Прижившиеся апикальные меристемы, через месяц после посадки были пересажены на питательную среду с содержанием тех же компонентов. Пересадку производили в биологические пробирки размером 40 х 120 мм, в течение 45…55 дней образовались регенеранты размерами 6…10 см. Далее эти микрорастения были расчеренкованы и получены микроклоны.

На этапе пересадки кластер-побегов приживаемость их достаточно высокая (75-90%). В течение 45-50 дней образовались регенеранты растений размерами 6…10 см. Далее мы приступили к их клональному микроразмножению. Растения-регенеранты разрезали на фрагменты, включавшие узел с листом и почкой (нижняя часть междоузлия длиннее верхней на 1…2 см). Полученные микрочеренки высаживали в биологические пробирки (40 х 120 мм) на агаровую среду.

Влияние регуляторов роста на развитие эксплантов винограда в условиях in vitro

Одним из важнейших и неотъемлемых компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Их тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода in vitro.

Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов происходила при всех концентрациях 6-БАП, кроме как при добавке препарата в количестве 5,0 мг/л, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли. Верхушки, выращиваемые на среде с концентрацией 0,1 мг/л 6-БАП развивались очень медленно. Самые лучшие результаты были достигнуты на среде с концентрацией 0,5…1,0 мг/л. (табл. 1).

Таблица 1

Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда в условиях in vitro (см)

Сорта	Концентрация, мг/л					НСР05
	0,1	0,5	1	2	5
Восторг	5,0	9,9	10,6	7,2	0,0	1,84
Кодрянка	5,1	11,5	11,9	7,9	0,0	2,06
Лакхеди мезеш	4,3	7,4	10,5	4,8	0,0	1,67
Подарок Магарача	4,4	7,0	9,2	5,0	0,0	1,56
Виорика	4,6	8,2	11,5	5,8	0,0	2,18
Ркацители	4,9	9,1	11,8	6,1	0,0	2,35

Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда в условиях in vitro

Другим веществом, обладающим цитокининовой активностью, явился препарат ДРОП. Действие препарата, оказываемое им на развитие экспланта — микропобегов различных сортов винограда (чем больше междоузлий с листом, тем больше и коэффициент размножения). Наиболее существенные различия в степени развития микропобегов винограда in vitro были обнаружены в варианте, содержащем ДРОП в концентрации 0,5 мг/л (табл. 2).

Число междоузлий с листом, развивающихся на микропобегах in vitro, помещенных на среды с разными концентрациями ДРОП, не имело существенных различий, кроме варианта, где уровень концентрации ДРОП был равен 0,1 мг/л. В этом случае отмечено максимальное число междоузлий с листом. В варианте опыта с высокой концентрацией ДРОП 2,0 и 5,0 мг/л было отмечено аномальное развитие микропобегов.

Таблица 2

Развитие микропобегов винограда на среде, содержащей ДРОП

Сорта	Показатели	Концентрация, мг/л					НСР05
		0,1	0,5	1	2	5
Восторг	Кол-во междоузл. с листом, шт	5,6	7,7	6,0	—	—
	Длина побега, см	7,2	9,8	7,1	—	—	1,36
Кодрянка	Кол-во междоузл. с листом, шт	4,2	6,0	5,4	—	—
	Длина побега, см	5,4	8,2	6,8	—	—	1,20
Лакхеди мезеш	Кол-во междоузл. с листом, шт	7,0	6,4	8,2	3,5	—
	Длина побега, см	8,4	7,5	9,0	4,4	—	1,48
Подарок Магарача	Кол-во междоузл. с листом, шт	5,6	7,1	5,0	2,3	—
	Длина побега, см	7,2	9,4	6,7	3,8	—	1,87
Виорика	Кол-во междоузл. с листом, шт	5,9	8,2	7,1	—	—
	Длина побега, см	8,0	9,2	8,4	—	—	1,02
Ркацители	Кол-во междоузл. с листом, шт	6,8	9,3	8,2	4,2	—
	Длина побега, см	8,1	10,6	9,8	4,8	—	1,64

При добавлении в питательную среду 2-изопептиладенина (2-ip) цитокининого характера действия отмечаются существенные различия в росте побега и количестве междоузлий в вариантах с концентрацией 0,5 мг/л и 1,0 мг/л, особенно следует выделить концентрацию 0,5 мг/л (табл. 3).

Таблица 3

Развитие микропобегов винограда на среде MS, содержащей 2-изопентиладенин (2-ip)

Сорта	Концентрация, мг/л					НСР05
	0,1	0,5	1	2	5
Восторг
Кол-во междоузл. с листом, шт	4,4	7,3	7,7	5,2	—
Длина побега, см	5,6	10,5	9,1	6,0	—	1,84
Кодрянка
Кол-во междоузл. с листом, шт	4,8	8,1	8,2	4,6	—
Длина побега, см	6,0	9,8	10,9	5,1	—	1,57
Подарок Магарача
Кол-во междоузл. с листом, шт	3,7	6,2	6,1	4,0	—
Длина побега, см	5,8	8,4	8,0	5,2	—	1,32
Виорика
Кол-во междоузл. с листом, шт	5,1	8,9	6,2	5,4	—
Длина побега, см	6,4	10,8	7,3	6,2	—	1,68

Фаза удлинения кластер-побегов

Для ускорения процесса удлинения кластер-побегов проводили изучение действия гибберелловой кислоты в различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опыт, при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК был достигнут наилучший результат. Такое сочетание препаратов ускоряло вытягивание стеблей у растений, и через две недели размер побегов достигал 25…26 мм.
Таким образом, проведенные нами эксперименты показали эффективное действие ГК и пониженной концентрации 6-БАП для удлинения побегов перед этапом укоренения.

Динамика развития побегов винограда на средах, содержащих 6-БАП и его сочетаний с ГК

1. 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК
2. 0,5 мг/л 6-БАП
3. 0,5 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК
4. 0,5 мг/л 6-БАП + 5,0 мг/л ГК

1. 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК
2. 0,5 мг/л 6-БАП
3. 0,5 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК
4. 0,5 мг/л 6-БАП + 5,0 мг/л ГК

Выводы

Проведенные исследования показали возможность успешного размножения испытуемых сортов винограда методом культуры изолированных тканей и органов in vitro, что объясняется высокой потенциальной способностью винограда к вегетативному размножению вообще и к микроклональному в частности.

Приживаемость апикальных меристем, из которых вырастает растение in vitro (10-12 см), дает возможность дальнейшего их культивирования и размножения (путем повторного черенкования), при котором возможно получение безвирусного посадочного материала.

Из испытанных регуляторов роста наиболее результативно проходила регенерация побегов при концентрации 6-БАП 0,5…1,0 мг/л. При массовом размножении побегов оптимальной оказалась концентрация 6-БАП 2 мг/л.

Действие ГК в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП 0,5 мг/л, ускоряло вытягивание стеблей у микрорастений in vitro.
Присутствие кинетина в питательной среде в комбинации с 6-БАП положительно влияло на развитие эксплантов. Так, на фоне концентрации 6-БАП 0,5 мг/л присутствие кинетина (0,5 мг/л) обеспечило максимальный коэффициент размножения для испытываемых сортов винограда

<