Мичуринский государственный аграрный университет
Мичуринск -Наукоград
Юг-Полив

Батукаев А.А.
Агротехнологический институт ЧГУ
Чеченский НИИ сельского хозяйства

Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала винограда

Современное виноградарство России должно базироваться на производстве сертифицированного посадочного материала. Основная цель исследований заключалась в совершенствовании технологий клонального микроразмножения с использованием регуляторов роста. Задача состоит в получении здорового посадочного материала винограда и введение системы сертификации посадочного материала по образцу европейских стран.

Технология производства оздоровленного посадочного материала в качестве составной части включает биотехнологические приемы, комплексное оздоровление с использованием культуры изолированных апексов, ускоренное размножение оздоровленных экземпляров на искусственных питательных средах и создание коллекций оздоровленных форм in vitro

К основным преимуществам использования биотехнологических приемов можно отнести следующие:

  • возможность получения оздоровленного от вирусов и бактериального рака посадочного материала;
  • быстрое размножение ценных клонов;
  • возможность работы в течении всего года и планирование выпуска материала к определенному сроку;
  • при интродукции растений устраняется вероятность завоза и распространения карантинных растений;
  • паспортизация сортов и форм с помощью молекулярно-генетического маркирования и установление филлогенетических связей;
  • длительное хранение материала в условиях in vitro.

Объекты и методы исследований

Объектом исследований явились комплексно-устойчивые сорта винограда селекции Всероссийского НИИВиВ имени Я.И.Потапенко, НИВиВ «Магарач» Украинской академии аграрных наук, молдавской, венгерской селекции и др.

В качестве исходного материала были взяты интенсивно растущие зеленые побеги винограда, которые разрезали на одноглазковые черенки и далее проводили вычленение меристем в ламинарных боксах.

Одноглазковые черенки перед вычленением меристемы стерилизовали в 2 %-м растворе гипохлорита натрия. Простерилизованные органы помещали в стерильную чашку Петри. Перед вычленением с верхушки глазка удаляли покровные чешуи, последовательно обнажая верхушечную меристему с примордиальными листочками. Эту операцию проводили с помощью препаровальной иглы под стереоскопическим микроскопом МБС-10, установленным в пылезащитной камере (ламинар-боксе). Вычленяли меристемы от 200 до 400 микрон специальной препаровальной иглой и немедленно помещали на поверхность агаризованной среды в чашки Петри, которые в свою очередь были размещены в культуральной комнате с соответствующими условиями: освещенность 3…4 тыс. люкс, температура 27…28С, относительная влажность воздуха 65…70 %.

При этом использовали модифицированную питательную среду MS (Мурасиге и Скуга) с витаминами: тиамин — 1 мг/л, пиридоксин — 1 мг/л, никотиновая кислота — 1 мг/л, мезоинозит — 50 мг/л, источник углерода (сахароза) — 2 %, агар — 0,7 % и доводили рН до 6,4…6,5.

В качестве регуляторов роста в питательную среду добавляли ауксины и цитокинины в различных концентрациях и сочетаниях. Из группы ауксинов было изучено влияние индолил-масляная кислота (ИМК) и индолил-уксусная кислота (ИУК), из группы цитокининов: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентил-аденин (2iP), кинетин, а также гибберелловая кислота (ГК).

Культивирование растительного материала осуществляли на первом этапе в чашках Петри, далее в пробирках размером 40 х 120 мм, содержащих 20 мл питательной среды.

Результаты исследований

Проведенные наблюдения показали, что на первом этапе выращивания (2 недели) часть меристем (40-60% в зависимости от сорта), начали некротизировать. Оставшиеся меристемы через месяц после посадки развились в микропобеги размерами 2…2,5 мм. Эти микропобеги повторно пересаживали на такую же по составу питательную среду. Пересадку производили в биологические пробирки.

Степень приживаемости апикальных меристем на этапе введения в культуру in vitro находится в среднем на уровне 40-50%.

Прижившиеся апикальные меристемы, через месяц после посадки были пересажены на питательную среду с содержанием тех же компонентов. Пересадку производили в биологические пробирки размером 40 х 120 мм, в течение 45…55 дней образовались регенеранты размерами 6…10 см. Далее эти микрорастения были расчеренкованы и получены микроклоны.

На этапе пересадки кластер-побегов приживаемость их достаточно высокая (75-90%). В течение 45-50 дней образовались регенеранты растений размерами 6…10 см. Далее мы приступили к их клональному микроразмножению. Растения-регенеранты разрезали на фрагменты, включавшие узел с листом и почкой (нижняя часть междоузлия длиннее верхней на 1…2 см). Полученные микрочеренки высаживали в биологические пробирки (40 х 120 мм) на агаровую среду.

Влияние регуляторов роста на развитие эксплантов винограда в условиях in vitro

Одним из важнейших и неотъемлемых компонентов питательной среды являются регуляторы роста. Их тщательный подбор и выявление оптимальных концентраций позволяют повысить эффективность метода in vitro.

Проведенные эксперименты показали, что регенерация побегов происходила при всех концентрациях 6-БАП, кроме как при добавке препарата в количестве 5,0 мг/л, когда верхушки сразу начинали чернеть и гибли. Верхушки, выращиваемые на среде с концентрацией 0,1 мг/л 6-БАП развивались очень медленно. Самые лучшие результаты были достигнуты на среде с концентрацией 0,5…1,0 мг/л. (табл. 1).

Таблица 1

Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда в условиях in vitro (см)

Восторг5,09,910,67,20,01,84
Кодрянка5,111,511,97,90,02,06
Лакхеди мезеш4,37,410,54,80,01,67
Подарок Магарача4,47,09,25,00,01,56
Виорика4,68,211,55,80,02,18
Ркацители4,99,111,86,10,02,35

Влияние 6-БАП на развитие одноглазковых черенков винограда в условиях in vitro

Другим веществом, обладающим цитокининовой активностью, явился препарат ДРОП. Действие препарата, оказываемое им на развитие экспланта — микропобегов различных сортов винограда (чем больше междоузлий с листом, тем больше и коэффициент размножения). Наиболее существенные различия в степени развития микропобегов винограда in vitro были обнаружены в варианте, содержащем ДРОП в концентрации 0,5 мг/л (табл. 2).

Число междоузлий с листом, развивающихся на микропобегах in vitro, помещенных на среды с разными концентрациями ДРОП, не имело существенных различий, кроме варианта, где уровень концентрации ДРОП был равен 0,1 мг/л. В этом случае отмечено максимальное число междоузлий с листом. В варианте опыта с высокой концентрацией ДРОП 2,0 и 5,0 мг/л было отмечено аномальное развитие микропобегов.

Таблица 2

Развитие микропобегов винограда на среде, содержащей ДРОП

ВосторгКол-во междоузл. с листом, шт5,67,76,0
Длина побега, см7,29,87,11,36
КодрянкаКол-во междоузл. с листом, шт4,26,05,4
Длина побега, см5,48,26,81,20
Лакхеди мезешКол-во междоузл. с листом, шт7,06,48,23,5
Длина побега, см8,47,59,04,41,48
Подарок МагарачаКол-во междоузл. с листом, шт5,67,15,02,3
Длина побега, см7,29,46,73,81,87
ВиорикаКол-во междоузл. с листом, шт5,98,27,1
Длина побега, см8,09,28,41,02
РкацителиКол-во междоузл. с листом, шт6,89,38,24,2
Длина побега, см8,110,69,84,81,64


При добавлении в питательную среду 2-изопептиладенина (2-ip) цитокининого характера действия отмечаются существенные различия в росте побега и количестве междоузлий в вариантах с концентрацией 0,5 мг/л и 1,0 мг/л, особенно следует выделить концентрацию 0,5 мг/л (табл. 3).

Таблица 3

Развитие микропобегов винограда на среде MS, содержащей 2-изопентиладенин (2-ip)

Восторг
Кол-во междоузл. с листом, шт4,47,37,75,2
Длина побега, см5,610,59,16,01,84
Кодрянка
Кол-во междоузл. с листом, шт4,88,18,24,6
Длина побега, см6,09,810,95,11,57
Подарок Магарача
Кол-во междоузл. с листом, шт3,76,26,14,0
Длина побега, см5,88,48,05,21,32
Виорика
Кол-во междоузл. с листом, шт5,18,96,25,4
Длина побега, см6,410,87,36,21,68

Фаза удлинения кластер-побегов

Для ускорения процесса удлинения кластер-побегов проводили изучение действия гибберелловой кислоты в различных концентрациях в сочетании 6-БАП. Как показал опыт, при сочетании 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК был достигнут наилучший результат. Такое сочетание препаратов ускоряло вытягивание стеблей у растений, и через две недели размер побегов достигал 25…26 мм.
Таким образом, проведенные нами эксперименты показали эффективное действие ГК и пониженной концентрации 6-БАП для удлинения побегов перед этапом укоренения.

Динамика развития побегов винограда на средах, содержащих 6-БАП и его сочетаний с ГК

  1. 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК
  2. 0,5 мг/л 6-БАП
  3. 0,5 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК
  4. 0,5 мг/л 6-БАП + 5,0 мг/л ГК

  1. 0,5 мг/л 6-БАП + 1,0 мг/л ГК
  2. 0,5 мг/л 6-БАП
  3. 0,5 мг/л 6-БАП + 2,0 мг/л ГК
  4. 0,5 мг/л 6-БАП + 5,0 мг/л ГК

Выводы

Проведенные исследования показали возможность успешного размножения испытуемых сортов винограда методом культуры изолированных тканей и органов in vitro, что объясняется высокой потенциальной способностью винограда к вегетативному размножению вообще и к микроклональному в частности.

Приживаемость апикальных меристем, из которых вырастает растение in vitro (10-12 см), дает возможность дальнейшего их культивирования и размножения (путем повторного черенкования), при котором возможно получение безвирусного посадочного материала.

Из испытанных регуляторов роста наиболее результативно проходила регенерация побегов при концентрации 6-БАП 0,5…1,0 мг/л. При массовом размножении побегов оптимальной оказалась концентрация 6-БАП 2 мг/л.

Действие ГК в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 6-БАП 0,5 мг/л, ускоряло вытягивание стеблей у микрорастений in vitro.
Присутствие кинетина в питательной среде в комбинации с 6-БАП положительно влияло на развитие эксплантов. Так, на фоне концентрации 6-БАП 0,5 мг/л присутствие кинетина (0,5 мг/л) обеспечило максимальный коэффициент размножения для испытываемых сортов винограда

<

Члены АППЯПМ
Татарин Вадим Григорьевич

Татарин Вадим Григорьевич

генеральный директор ООО «Ангелинский сад» (Краснодарский край)

Основные направления работы АППЯПМ

 







Авторские права © 2008-2016 АППЯПМ. Все права защищены.
Запрещено использование материалов сайта без согласия его авторов и обратной ссылки.

Яндекс.Метрика Рейтинг@Mail.ru