Особенности клонального микроразмножения ремонтантных форм малины

Введение

Ремонтантные формы малины — уникальные ягодные растения, способные в отличие от обычных растений малины плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины обладают низким потенциалом вегетативного размножения по сравнению с летними сортами, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе [3].

Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. По сравнению с традиционными способами размножения малины — корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ. Главные из них высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции.

За последние десятилетия в нашей стране и за рубежом были проведены многочисленные иссле-дования по совершенствованию метода клонального микроразмножения с целью производства высококачественного посадочного материала малины [5, 14]. Выполненные работы позволили определить оптимальные сроки изолирования эксплантов, оптимизировать состав питательных сред, отработать приемы адаптации полученных растений к нестерильным условиям выращивания. В настоящее время этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала малины в некоторых селекционных программах [7].

Однако биологические особенности ремон-тантных форм малины, связанные с их сложным межвидовым происхождением, стали причиной низкой эффективности предлагаемых биотехно-логических методов размножения малины на не-которых этапах культивирования in vitro. В связи с этим возникла необходимость оптимизации процесса клонального микроразмножения новых ре-монтантных форм малины.

Материалы и методы исследования

Весь селекционный материал ремонтантной малины (220 генотипов), используемый нами в работе, был создан на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.). Исследования проводились в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА.

Изолирование эксплантов осуществляли в конце лета — начале осени, либо в осенний период. Заготовленные побеги хранили в бытовом холодильнике, при температуре 4 °С. Сегменты стебля с почкой стерилизовали в 0,1 % растворе сулемы (HgCl2) или 0,1 % мертиолята (C9H9HgNaO,S) в течение 3 минут с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Культивирование первичных эксплантов и последующее размножение осуществляли в модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина вводили 6-бен- зиламинопурин (6-БАП) 0,5 мг/л, тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,2 мг/л, N-(2 хлор- 4-пиридил)-Ы-фепилмочевина (CPPU) в концентрации 0,2-1 мг/л. При размножения растений изучали влияние цитокининов 6-БАП в концентрациях 0,5-2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05,  0.1 и 0.2 мг/л.

На этапе укоренения использовали часть минеральной среды Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов ризогенеза в среду вводили ПУК или ИМК.

Результаты и обсуждения

Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов — конец мая, начало июня. Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выявлена и на ремонтантных формах малины [4]. Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых, ограниченное число подходящих почек, которые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов. При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/пли не- приживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифферен- цировка почек по цветочному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при заготовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов.

В настоящее время изолирование эксплантов ремонтантных генотипов малины проводится нами в осенний период, сразу после их селекционной оценки. Однако большинство почек у малины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культивировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Рост степени приживаемости эксплантов и регенерации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины — тидиазурон и CPPU, которые в низких концентрация (0.1-0.2 мг/л) оказались более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда.

Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их раз-множения. При этом даже в загущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек, сформировавшихся на однолетних побегах, быстрее чем в весенний период, происходит регенерация растений, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения антисептиками при стерилизации.

Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной степени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов и, как исключительное явление, их распускание. Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образования не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие побеги сохраняют активный рост.

Регенерация побегов из пазушных почек про-исходит по периферии их основания из запасных меристем. В среднем образуется около 2 побегов на эксплант. Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цветочных зачатков возможна адвентивная регенерация из них побегов. Однако в связи с возможным появлением сомаклональных вариантов при таком типе регенерации [2] его необходимо применять лишь в исключительных случаях.

Известно, что регенерационный потенциал на-ходится в прямой зависимости от его генотипа. Так, в ряде исследований продемонстрировано, что среди представителей рода Rubus ежевика отличается большим, чем малина, коэффициентом размножения in vitro, а также частотой регенерации при адвентивном органогенезе [12]. Среди представителей одного вида растений могут вы-делятся сорта как с большей, так и с меньшей регенерационной способностью. Возможно, что признаки, определяющие способность к размно-жению у растений in vitro, коррелируют с такими показателями в полевых условиях. Однако основа-тельных экспериментов, подтверждающих это на ремонтантных формах малины, не проводилось, несмотря на актуальность такой информации при планировании работы по тиражированию сортов с использованием культуры ткани. В наших исследо-ваниях при включении большого количества гено-типов было зафиксировано, что высокорослые, ак-тивно растущие в полевых условиях сорта ремон-тантной малины сохраняют такую же способность и в условиях in vitro. Так, из межвидовых сортов ремонтантной малины большим коэффициентом размножения и способностью к ризогенезу in vitro отличается сорт Бабье лето-2, а у трудно укореняе-мого in vitro сорта Геракл в полевых условиях наряду с низкорослыми побегами образуется слабая по сравнению с другими сортами корневая система. Такую же аналогию можно провести между низко-рослым сортом Пингвин, который отличается от-носительно низким коэффициентом размножения в естественных условиях, и высокорослым, активно растущим сортом Оранжевое чудо.

Среди сортов, выделенных из сотен элитных сеянцев нами не было отмечено генотипа, который бы не поддавался удовлетворительному размножению in vitro на стандартных средах с 6-БАП (1-2 мг/л).  Однако выделялись генотипы, обладающие очень низкими коэффициентами размножения (не более 2): 6-Х-Ж, 15-220-2 и 16-67-1.

Из существующих способов увеличения коэф-фициента размножения малины можно выделить следующие:

1. повышение концентрации применяемого ци- токинина. Как правило, рост содержания 6-БАП в среде приводит к образованию большего количества дополнительных побегов. Для малины максимальная концентрация не должна превышать 3 мг/л. Чрезмерно высокие концентрации цитоки- нинов приводят к образованию побегов с морфо-логическими нарушениями, которые проявляются в виде коротких деформированных побегов, скру-ченных листьев, стекловидных органов с признаками гипероводненности;
2. последовательное чередование высоких и низких концентраций 6-БАП [8];
3. использование в качестве источника цито- кинина производных дифенилмочевины [1], которые в более низких концентрациях способны вызывать пролиферацию побегов. Превышение оптимальных концентраций цитокининов ряда дифенилмочевины приводит к появлению морфо-логических нарушений у растений, более суще-ственных, чем 6-БАП.

Не исключено, что новыми способами индукции образования дополнительных побегов могут быть и другие химические и физические факторы.

Из испытанных питательных сред, приготовлен-ных по прописям Мурасиге-Скуга [10], Андерсона [6] и Ли и де Фоссарда [9], первая оказалась наиболее оптимальной для культивирования малины на этапах введения в культуру, собственно размножения и укоренения (1/2 часть). Среда Мурасиге- Скуга (МС) использовалась в большинстве случаев при размножении малины in vitro. Однако следует учитывать, что эта среда в нашей работе содержит тройную концентрацию хелата железа по сравнению с оригинальной прописью.

Среди физических факторов критическое влияние на культивирование малины in vitro оказывает температура. Высокие значения этого показателя (около 30 °С), отмечаемые в весенне-летний период в отсутствии кондиционирования, могут привести к значительным потерям растительного материала. При воздействии высоких температур происходит интенсивное выделение растительными тканями этилена и углекислоты, которые в изолированной системе in vitro накапливаются в высоких концентрациях. Этилен, являясь гормоном старения и созревания, приводит к быстрой гибели растений, особенно уже закончивших рост. В связи с этим при выращивании растений in vitro целесообразно искусственно поддерживать оптимальную температуру в культивационном помещении или избегать размножения растений в жаркие месяцы. Несомненный интерес представляет информация, связанная с определением оптимальных температур и термопериода для культивирования растений малины на каждом этапе клонального микроразмножения. В большинстве случаев в научных работах рекомендуют культивирование растений малины при температуре 20-22 °С [13].

Традиционно для индукции ризогенеза микро-черенков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. На средах с ИУК укореняются лишь на 30-40 % микрочеренков, и для них более эффективна ИМК (0,5 мг/л).

Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза — до 100 %.

Перспективное направление в получении по-садочного материала малины — укоренение микро-побегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1 с.

Успех укоренения определяется качеством ис-ходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений у крупных побегов выше, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов). На нем проводят уменьшение концентрации цитокинина 6-БАП с 1-2 мг/л до 0,2-0,3 мг/л.

Для ускорения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию вита- минно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины. Полученные результаты позволяют заключить, что введение в питательную среду МС витамин- но-минерального комплекса «Компливит» (4 г/л) приводит к росту коэффициента размножения и высоты растений. Такой эффект очень важен на последнем в субкультивировании этапе элонгации для получения более крупных побегов.

Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений (слабым функционированием устьичного аппарата, отсутствием кутикулярного слоя и корневых волосков) может наблюдаться значительные потеря высаженного в субстрат материала [11]. Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его pH, влажность и температура воздуха.

В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады, состоящих из общего поддона, кассет и полупрозрачной крышки, обеспечивающей высокую влажность среды. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно проводится опрыскивание растений и полив по мере необходимости.

После одного-двух месяцев адаптации в ми-нипарниках, укорененные растения малины с не-сколькими образовавшимися листочками распи-кировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа «Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений.

Литература

1. Высоцкий В.А. Особенности клонального ми-кроразмножения некоторых форм ремонтантной малины // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. научных трудов ВСТИСП. — М., 1996. Т.З. — С. 90-95.
2. Высоцкий В.А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур // Сельскохозяйственная биология, 1995. №5.-С. 57-63.
3. Казаков И.В., Евдокименко С.Н. Малина ремонтантная. ГНУ ВСТИСП. М. 2007. — 288 с.
4. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В. и др. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции межвидовых ремонтантных форм малины // Сельскохозяйственная биология, 1998.-№3.-С. 51-56.
5. Туровская Н.И., Стрыгина О.В. Микро- клональное размножение малины // Садоводство и виноградарство, 1990. -№ 8. — С. 26-29.
6. Anderson W.C. Tissue culture propagation of red and black raspberry, Rubus idaeus and Rubus occidentalis. //Acta Horticulture, 1980.-V. 112.-P. 13-20.
7. Hall H., Hummer K.E., Jaimieson A., and others. Plant Breeding Reviews: Raspberry Breeding and Genetics. New Jersey: Wiley Blackwell, 2009. — 32. — P. 39-382.
8. Jin-Hu Wu, Shirley A. Miller, Harvey K. Hall and Pauline A. Mooney //Factors affecting the efficiency of micropropagation from lateral buds and shoot tips of Rubus Plant Cell, Tissue and Organ Culture. — 2009. Vol. 99. — № 1,P. 17-25.
9. Lee E.C.M., Fossard R.A. Regeneration of strawberry plants from tissue cultures // Comb. Proc. (Intern. Plant Propagators Soc. Miltown, N.-Y.). — 1975. V. 25. — P. 277-285.
10. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantamm. 1962. — V. 15. — № 13. P. 473-497.
11. Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants. 1987.-V. 5.-344 p.
12. Reed B.M. Multiplication of Rubus germplasm in vitro a screen of 256 accessions. // J. Amer. Soc. Hort. Sci, 1990. — V. 44. — № 3. — P. 141-148.
13. Turk B.A., Swartz H.J., Zimmerman R.H. Adventitious shoot regeneration in vitro-cultured leaves of Rubus genotypes // Plant Cell. Tiss. Org. Cult, 1994. — V. 38.-P. 11-17.
14. Wellander M. In vitro culture of red raspberry (Rubus idaeus) for mass propagation // Journal of Horticulture Science, 1985 — V. 60. — P. 493-499.